¿Qué es el Streptococcus pneumoniae?

 Streptococcus pneumoniae 

Importancia clínica.

    Streptococcus pneumoniae continúa siendo el principal agente bacteriano causante de infecciones adquiridas en la comunidad como otitis media, neumonía, bacteriemia y meningitis, alrededor del mundo. Este agente además es de exigencia en su cultivo. Por lo que dificulta su aislamiento y conservación. (Cardoso, 2007)

    La mayoría de las publicaciones coinciden en que 30 a 40% de las OMA, 40% de las sinusitis agudas y 50% de las neumonías bacterianas adquiridas en la comunidad, son causadas por S. pneumoniae. En países donde se implementó extensivamente la vacunación anti Haemophilus influenzae b con el antígeno PRF conjugado, es la primera causa de meningitis bacteriana aguda, en lactantes más allá del período neonatal, y en ausencia de brotes epidémicos de enfermedad meningocóccica. S. pneumoniae se transmite por vía aérea, significando un riesgo mayor las nucleo-gotitas de < 10 µm que permanecen en suspensión más de 30 minutos y alcanzan fácilmente el alvéolo con riesgo de producir infección del parénquima pulmonar. (Ruvinsky, 2001)

    La incidencia con la que se dan enfermedades causadas por el S. pneumoniae como la neumonía neumoccócica es muy alta. (Ruvinsky, 2001)

Referencias.

-Ruvinsky, R.O.(2001). Streptococcus pneumoniae: Epidemiología y resistencia a antimicrobianos de las enfermedades invasoras en Latinoamérica. Revista chilena de infectología, 18(Supl. 1), 10-14. https://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182001000000003
-Cardoso-Hernández, G & Velázquez-Guadarrama, N. (2007). Importancia clínica del Streptococcus pneumoniae tolerante a la vancomicina. Revista de enfermedades infecciosas en pediatría. Recuperado el 30 de septiembre de 2022 de https://www.medigraphic.com/pdfs/revenfinfped/eip-2007/eip071b.pdf

Patologías y manifestaciones clínicas causadas por S. pneumoniae.

     La exposición o infección por streptococcus pneumoniae puede orientarse a distintas patologías, en las cuales se comparten algunas de las manifestaciones clínicas o sintomatología, como son:

1. Otitis media: Aparece súbitamente otalgia con fiebres, malestar general y perdida de audición, así como irritabilidad, diarrea y hasta vómito.
2. Neumonía: Su sintomatología varía desde moderados a graves dependiendo de varios factores, como pueden ser la edad, entre otros. Algunas de las manifestaciones son dolor en el pecho al respirar y toser, fatiga, flemas, escalofríos, fiebre, dificultades de respiración, desorientación o cambios de percepción en caso de ser adulto mayor, náuseas, vómito o diarrea.

2. Meningitis: Similares a los de la influenza inicialmente, presenta fiebre bastante alta, rigidez en el cuello, dolor de cabeza intenso, nauseas y vomito, confusión o dificultad para la concentración, convulsiones, somnolencia o dificultad para caminar, sensibilidad a la luz, falta de apetito y sed, erupción cutánea. 

3. Sinusitis: Presenta inflamación nasal, secreción espesa y descolorida de la nariz, secreción por la parte posterior de la garganta, nariz tapada o congestión que ocasiona dificultad para respirar los fosas nasales, dolor, sensibilidad e hinchazón alrededor de los ojos, mejillas, nariz y frente, reducción del sentido del olfato y gusto, así como dolor de oído, cabeza, en el maxilar superior y dientes, tos o carraspera, mal aliento, fatiga y dolor de garganta.

Referencia.
-Bush, L.M., & Vázquez-Pertejo, M.T. (2021). Infecciones por neumococo. Manual MSD. Recuperado el 30 de septiembre de 2022 de https://www.msdmanuals.com/es-mx/professional/enfermedades-infecciosas/cocos-grampositivos/infecciones-por-neumococos
-Gómez-Barreto, M.C., Calderón-Jaimes, E., Rodríguez, R.S., Espinoza-Monteros, L.E. (2012). Características clínico-microbiológicas de la meningitis por Streptococcus pneumoniae resistente a la penicilina. Artículo recuperado el 30 de septiembre de 2022 de https://www.scielosp.org/pdf/spm/v41n5/41n5a08.pdf

Toma de muestra e identificación de Streptococcus pneumoniae

 

Para realizar un medio de cultivo para ver si se trata o no de S. pneumoniae es necesaria una muestra de esputo, el esputo es el producto de una expectoración la cual consiste en el acto de arrancar y arrojar por la boca mediante tos las flemas y secreciones que se depositen en la laringe, tráquea y bronquios. 

Para realizar un examen directo con esputo se debe seleccionar una parte de la muestra que corresponde a la parte más densa o purulenta para posteriormente realizarle una coloración de Gram la cual permite el control de la calidad del esputo para evaluar el grado de contaminación con bacterias del tracto superior además de que se confirma mediante la observación si se trata de una bacteria gram positiva en cocos capsulada (Cacho-Calvo y cols., 2007). 

Para evaluar la calidad del esputo obtenido se utiliza el sistema de graduación establecido por Murray y Washington (Tabla 12) en el cual se establece que la observación de un gran número de células epiteliales en los grupos 1 al 4 indican que se trata de una muestra contaminada con secreciones orofaríngeas mientras que la establecida con el numero 5 son las que se consideran clínicamente significativas y corresponden a aquellas muestras de esputo con <10 células epiteliales por campo y 25 leucocitos por campo (Cacho-Calvo y cols., 2007). 

Tabla 12. Criterios de Murray y Washington para la evaluación de la calidad de las muestras de esputo. 

Para el cultivo de esputo se utilizan medios como el agar sangre y el agar chocolate los cuales se incuban en una atmosfera de microareofilia y atmósfera de CO2 al 5% en un periodo de 18-24 horas.

El agar sangre de carnero al 5% es un medio de cultivo enriquecido que esta suplementado con sangre de carnero, permite el crecimiento de microorganismos exigentes nutricionalmente y otorga una buena visualización de reacciones de hemolisis. 

El agar chocolate es un medio de cultivo enriquecido y no selectivo que contiene glóbulos rojos que son lisados a un calentamiento de 56 °C (Pírez & Mota, 2006) 

Streptococcus pneumoniae en los medios de cultivo se identifica de esta manera: 

• Agar sangre: se observa α-hemolisis parcial formándose colonias pequeñas transparentes brillantes con halo verde brillante debido a la biliverdina producida por la ruptura de los eritrocitos contenidos en el medio. 
• Agar chocolate: se observa el crecimiento de colonias lisas, pequeñas, redondas, mucoides, transparentes con α-hemolisis. 

Sin embargo, es necesario confirmar la sospecha de la presencia de este patógeno utilizando diferentes técnicas de identificación bioquímica y las pruebas de susceptibilidad. 

• Prueba catalasa: el fundamento de esta técnica se basa en encontrar o no la presencia de la enzima catalasa, la catalasa cataliza la degradación de agua oxigenada en agua y oxígeno, no se encuentra presente en los organismos aerobios por lo que S. pneumoniae es negativo a catalasa. 
• Prueba de solubilidad en bilis: en esta prueba se detecta la lisis de las células en un tubo que contiene sales biliares, si el tubo se aclara o pierde turbidez el resultado es positivo. 
• Prueba de susceptibilidad a optoquina: la optoquina inhibe el desarrollo de S. pneumoniae por lo que al colocar el disco con este antibiótico no habrá crecimiento alrededor de la optoquina. 

(Castillo y cols., 2017).

Figura 1. Esquema general para evaluar muestra de esputo. 

Como último punto se realiza la lectura de las pruebas bioquímicas y pruebas de susceptibilidad. Así mismo se realiza la interpretación de dichas pruebas y antibiograma para entregar el reporte de resultados. 

Si se trata de una bacteria gram positiva de forma de diplococos, encapsulada, catalasa negativo, sensible a optoquina y positivo a solubilidad en bilis se trata se Streptococcus pneumoniae (Figura 2). 

Figura 2. Identificación de Streptococcus pneumoniae. 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 

• Cacho-Calvo, M.A., Medeguer-Peinado, M.A., Oliver-Palomo, A., y Puig de la Bellacasa, J. (2007). Diagnóstico microbiológico de las infecciones bacterianas del tracto respiratorio inferior. Procedimientos en Microbiología Clínica. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. EIMC. pp. 1-25
• Castillo, M. C., Córdova, G. L., Ganoza, E. M., García, M. O., Velásquez, M. L., & Sanabria, J. C. (2017). Evaluación comparativa de Agar Sangre de Carnero y Agar Sangre Humana en el aislamiento de Streptococcus beta hemolíticos de pacientes con faringitis del Hospital Almanzor Aguinaga Asenjo de Chiclayo, Perú. 2006. Revista Médica Vallejiana, 4(2), 148-154.
• Pírez, M., & Mota, M. (2006). Morfología y estructura bacteriana. Temas de bacteriología y virología médica, 23-42.

Tinción de Gram

La tinción de Gram permite observar la morfología microscópica característica, para esto se debe realizar un frotis a partir de una muestra de esputo previamente recolectada (OPS, 2004).

Para la realización del frotis se debe seleccionar la partícula útil de la muestra, constituida por la parte más densa o purulenta. Si hay varias porciones purulentas, se deben mezclar cuidadosamente con los aplicadores y tomar una porción de la mezcla. En caso de observarse solo pequeñas partículas purulentas, escoger tres o más de ellas y mezclarlas en el mismo portaobjeto para homogeneizarlas (Velasco et al., 2011).

Una vez que se realiza el frotis, se debe dejar secar para fijarlo al calor y posteriormente realizar la tinción de Gram para observarlo al microscopio con un objetivo de inmersión (100X) y determinar la morfología microscópica de la muestra (OPS, 2004).

Streptococcus pneumoniae coloreado con Gram (figura 1) se observa como cocos Grampositivos lanceolados en cadenas cortas o pares, rodeados de un halo blanco debido al alto contenido de polisacáridos no teñidos pertenecientes a su cápsula (Velasco et al., 2011).

Figura 1. Tinción de Gram de S. pneumoniae

Referencias bibliográficas:

1. Organización Panamericana de la Salud. (2004). Programa de vigilancia de los serotipos y resistencia antimicrobiana de Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae: Manual de procedimientos del proyecto SIREVA II.
2. Velasco, J., Araque, M. D. C., Araujo, E., Longa, A., Nieves, B., Ramírez, A. C., ... & Velazco, E. (2011). Manual práctico de bacteriología clínica.

Cultivo

S. pneumoniae es un microorganismo difícil de cultivar (fastidioso), por lo que requiere medios enriquecidos para su aislamiento primario. Los medios utilizados para su cultivo son agar sangre de carnero 5% y agar chocolate para observar la hemolisis producida (OPS, 2004).

La muestra se siembra por agotamiento por estriado en placas de agar sangre y agar chocolate y se incuba en una atmósfera de CO2 al 5% durante 24 horas. Después de la incubación las cajas son examinadas para observar las colonias con morfología y hemólisis característica (Velasco et al., 2011).

Las colonias de Streptococcus pneumoniae (Figura 1) son lisas, pequeñas, redondas, transparentes, con un aspecto mucoide y brillante, rodeadas de un halo de α-hemólisis por la destrucción parcial de los eritrocitos por la hemolisina presente en la bacteria (Velasco et al., 2011).

Figura 1.  S. pneumoniae en agar chocolate y sangre

Referencias bibliográficas

1. Organización Panamericana de la Salud. (2004). Programa de vigilancia de los serotipos y resistencia antimicrobiana de Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae: Manual de procedimientos del proyecto SIREVA II.
2. Velasco, J., Araque, M. D. C., Araujo, E., Longa, A., Nieves, B., Ramírez, A. C., ... & Velazco, E. (2011). Manual práctico de bacteriología clínica.

Prueba de LAP

La prueba de LAP es una prueba simple y rápida que contribuye a la identificación y diferenciación de cocos Gram positivos catalasa negativa en base a la actividad leucinoaminopeptidasa. Es una de las pruebas para la identificación de cocos grampositivos catalasa negativa; diferencia específicamente los géneros Aerococcus y Leuconostoc de Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, y Pediococcus (Bou y cols., 2011).

Fundamento

Los microorganismos que contienen la enzima leucinoaminopeptidasa (LAPasa), hidrolizan de forma rápida la leucina-β-naftilamida presente en los discos de L.A.P. y liberan β-naftilamina, que reacciona con el reactivo cinamaldehído formándose un compuesto de color rosado-rojo (Laboratorios Britania, 2011).

Procedimiento

Prueba de susceptibilidad a la optoquina

La prueba de susceptibilidad a la optoquina se realiza con un disco de 6 mm, con 5 μg de optoquina12 y tiene por objeto diferenciar las cepas de S. pneumoniae de las de estreptococo viridans. Las cepas susceptibles a optoquina corresponden a S. pneumoniae.

Desarrollo de la prueba:

1. Toque la colonia sospechosa α-hemolítica con un asa bacteriológica estéril y en una placa de agar sangre estríe para aislamiento en línea recta. Se pueden probar a la vez varias cepas en la misma placa, estriadas en líneas paralelas y marcadas apropiadamente.

2.Coloque asépticamente un disco de optoquina o disco “P” con un diámetro de 6 mm (que contenga 5 μg de ethilhidrocupreína) sobre la estría del inóculo, cerca del final donde el asa de alambre se colocó primero. Dado que el inóculo es estriado en línea recta, se pueden probar en la misma placa tres o cuatro colonias. 

3. Incube las placas en una incubadora de CO2 o en un frasco con la vela en extinción a 35°C durante 18–24 horas. 

4. Lea, registre e interprete los resultados.

• Las cepas α-hemolíticas con una zona de inhibición de crecimiento mayor de 14 mm de diámetro son neumococos.
• Las cepas α-hemolíticas sin una zona de inhibición son estreptococos viridans.

Prueba de susceptibilidad a la optoquina

En el caso de que las cepas α-hemolíticas tengan una zona de inhibición de 9 mm a 13 mm es sospechas de neumococos. Por lo tanto esta prueba se hace en conjunto con la prueba de solubilidad en bilis para a completar la caracterización e identificación.

Prueba de solubilidad en bilis

Las colonias de neumococo son solubles en bilis y pueden desaparecer o aparecer como colonias aplastadas; por el contrario, las colonias de estreptococo resistentes a la bilis no se verán afectadas. 

Desarrollo de la prueba:

1. Tomar una asa de la cepa sospechosa de un crecimiento fresco en una placa de agar sangre y preparar una suspensión de células bacterianas en 0,5 mL de salina estéril. La suspensión de células bacterianas deberá ser turbia, similar a una turbidez estándar de 0,5 ó 1,0 en la escala de McFarland.

• Si el crecimiento en la placa de la prueba de optoquina es suficiente, la suspensión puede hacerse con las células bacterianas obtenidas de la estría específica donde se sospecha la presencia de S. pneumoniae. 

• Cuando el crecimiento es insuficiente para hacer una suspensión de densidad apropiada en 0,5 mL de salina estéril, inocule una placa de agar sangre con el crecimiento sospechoso e incube toda la noche (durante 18-24 horas a 35°C en una atmósfera enriquecida en CO2 ) para preparar un cultivo fresco. 

2. Dividir la suspensión en dos cantidades iguales (0,25 mL por tubo). Añadir 0,25 mL de salina a uno de los tubos y 0,25 mL de desoxicolato de sodio al 2% (sales biliares) al otro. 

3. Para hacer una concentración al 2% de sales biliares, añadir 0,2 g de desoxicolato de sodio a 10 ml de salina. 

4. Agitar los tubos suavemente y colocarlos en baños maría a 35°C–37°C durante 2 horas. 

4. Examinar los tubos periódicamente para detectar lisis de las células en el tubo que contiene sales biliares. Si el tubo se aclara o pierde turbidez, el resultado es positivo. 

Prueba de sensibilidad en bilis

• Las cepas en las que la suspensión en el tubo se torna clara en la prueba de solubilidad en bilis deben ser notificadas como “solubles en bilis.”  Las cepas para las cuales la turbidez en el tubo de control de salina permanece igual, deben ser notificadas como negativas para la solubilidad en bilis (o “insoluble en bilis” o “resistente a la bilis”).

Pruebas serológicas

Inmunodiagnóstico

Este tipo de serología diagnostica utilizan pruebas que permiten la interacción antígeno anticuerpo para encontrar la presencia de enfermedades infecciosas con la finalidad de confirmar un diagnóstico especifico cuando el patógeno es difícil de detectar por medios directos. 

Mediante una muestra de sangre del paciente se analiza el suero en el cual se buscan inmunoglobulinas específicas que actúan durante la fase de infección. Cuando la infección está en su fase activa las IgM (de respuesta primaria) están presentes y son posibles de detectar en suero, al transcurrir de 2-4 semanas después del primer encuentro con el patógeno se encuentran presentes las IgG (respuesta secundaria) en el suero por lo que se dice que se presentó infección en un momento pasado. Puesto que se ha realizado la defensa del hospedador utilizando por ejemplo la opsonización de la bacteria (Prescott et al., 2004). 

Figura 1. Acciones inmunitarias adaptativas mediadas por inmunoglobulinas.

Un resultado positivo solo indica que el paciente esta o estuvo en contacto con una infección por lo que se utilizan pruebas para la detección de antígenos que emplean anticuerpos de captura para detectar en las muestras clínicas antígenos específicos propios del microorganismo. En estas pruebas generalmente los anticuerpos de captura se encuentran unidos a un soporte sólido, como las bolitas de látex recubiertas con anticuerpos específicos para detectar el material capsular y es visto al ojo humano mediante la observación de aglutinación con látex. 

Entre las estructuras de Streptococcus pneumoniae se encuentra la cápsula, que es una estructura que envuelve a la bacteria externa a la pared celular la cual tiene una naturaleza polisacárida compleja. Esta cápsula es la responsable de la patogénesis de las infecciones neumocócicas, esta composición capsular permite clasificar más de 90 serotipos capsulares de S. pneumoniae y a 45 serogrupos de esta (Brooks et al., 2010). 

Identificación de serotipo mediante prueba quellung 

La identificación de los serotipos se realiza mediante una reacción antígeno-anticuerpo utilizando antisueros específicos que induce a que la cápsula genere un tipo de hinchazón a la cual se le conoce como "quellung" (Preado, 2001). 

Figura 2. Prueba de Quellung. Se observa la "hinchazón" que presenta la capsula de S. pneumoniae. 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 

• Brooks, G. F., Butel, J. S., Ornston, L. N., Jawetz, E., Melnick, J. L., & Adelberg, E. A. (2010). Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg (25ª ed). McGraw Hill-Lange. México. Recuperado el 16 de agosto de 2021, de https://booksmedicos.org/ (pp. 83, 85 y 87). 
• Prescott, L.M., Harley, J.P. & Klein, D.A. (2004). Microbiología. (5a ed.). México, D.F.: McGraw-Hill. (pp. 101, 102, 109).
• Preado, V. (2001). Conceptos microbiológicos de Streptococcus pneumoniae: BASIC MICROBIOLOGICAL ASPECTS. Revista chilena de infectología, 18, 6-9.

Positivo en S. pneumoniae ¿Ahora qué hago?

La determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos es una de las tareas del laboratorio de microbiología clínica de mayor impacto en el manejo del paciente. Además, los estudios de sensibilidad son fundamentales para conocer las tendencias de resistencia en los microorganismos de importancia clínica y para definir la política de utilización de antimicrobianos. 

Fig 1. S. pneumoniae en agar sangre

Una vez confirmado un resultado a S. pneumoniae se realizan pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos, esto para ayudar a formular las recomendaciones para un tratamiento clínico.

Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos

Existen varios métodos que permiten desarrollar esta actividad antimicrobiana, como lo son las pruebas de difusión en disco, pruebas de dilución en agar o microdilución en caldo  y las pruebas por difusión en agar de gradiente antimicrobiano, sin embargo, el más utilizado por su valor eficiencia-costo es el método de difusión en disco.

    Metodología:

A partir de la previa identificación, se realiza biomasa del microrganismo (en agar sangre) y se prepara el medio donde se va a llevar a cabo la prueba de susceptibilidad (agar Mueller-Hinton adicionado al 5%de sangre de carnero).

Fig2. Esquema de la metodología para las pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos 

 

1.    Suspenda las colonias viables de un crecimiento de toda la noche en placa de agar sangre de carnero o agar chocolate en un tubo de caldo hasta alcanzar una suspensión bacteriana equivalente a una turbidez estándar de 0,5 en la escala de McFarland. Esta suspensión tiene que usarse en 15 minutos.

2.    Compare la densidad de la suspensión con la turbidez estándar de 0,5 en la escala de McFarland.

3.    Cuando logre la densidad exacta, introduzca un hisopo de algodón o dacrón en la suspensión bacteriana. Sáquelo del caldo y elimine el exceso de líquido presionando y rotando el hisopo contra la pared del tubo.

4.    Use el hisopo para inocular tres veces toda la superficie de la placa de agar de Mueller-Hinton suplementado, rotando la placa con un giro de 60 grados entre cada inoculación. Use el mismo hisopo con cada estría rotada, pero no reintroduzca el hisopo en el inóculo (la suspensión de células bacterianas).

5.    Deje secar el inóculo antes de colocar los discos en la placa (discos de oxacilina y ceftriaxona principalmente, y en el caso de la bacteria sea sensible a la oxacilina se ponen los discos de penicilina. El disco de cloranfenicol ya no es tan usado debido a los efectos secundarios). Esto normalmente toma unos minutos, pero nunca más de 15.

6.    Cuando la placa esté seca, coloque los discos de antimicrobianos en las placas. Use pinzas estériles para poner los discos en el agar Mueller-Hinton y presione suavemente para asegurar que los discos se adhieran al agar. La difusión de la droga en el disco comienza inmediatamente, por tanto, una vez que el disco toca la superficie del agar no debe ser movido.

7.    Incube las placas en posición invertida en atmósfera de CO2 al 5% durante 20-24 horas a 35°C. Si no se dispone de incubadora de CO₂ , se puede usar un frasco con una vela en extinción.

8.    Después de una incubación de toda la noche, mida el diámetro de cada zona de inhibición con una regla o un calibrador. Las zonas de inhibición en el medio que contiene sangre se miden desde el borde superior de la placa sin tapa. Debe tener cuidado de no tocar el disco ni la superficie del agar. Esterilice la regla ocasionalmente para prevenir la transmisión de bacterias. Las zonas de inhibición se miden como el diámetro, desde el borde de la última colonia visible. Registre los resultados en milímetros (mm).

9.    Interprete la susceptibilidad a los antimicrobianos de la cepa de la prueba (y compruebe que los resultados para la cepa de CC de S. pneumoniae. Se clasifican como resistente (R) y sensible (S).

Bibliografía:

Perilla, M. J., Ajello, G., Bopp, C., Elliott, J., Facklam, R., Knapp, J. S., ... & Dowell, S. F. (2009). Manual de laboratorio para la identificación y prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos de patógenos bacterianos de importancia para la salud pública en el mundo en desarrollo. Medicina & Laboratorio, 15(01-02), 69-91

Martínez-Martínez, L. (2003). El futuro de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 21(52), 64-71